Badania Nobel

Tlenek azotu – wszechstronna molekuła

WSTĘP

Dość dawno temu telewizja emitowała film o odważnych ludziach, którzy przewozili ciężarówkami nitroglicerynę. Szczególnie zapadła mi w pamięć scena, w której kierowca musiał przejechać osobę przechodzącą przez ulicę. Dlaczego musiał ? Nitrogliceryna jest związkiem silnie wybuchowym i nagłe hamowanie spowodowałoby eksplozję, która zabiłaby przechodnia jak i kierowcę. Trzeba było więc wybrać mniejsze zło. Przykład nitrogliceryny jest jednym z wielu, który uświadamia nam, że odkrycie dokonane przez człowieka może mieć dwie strony. Związek ten jest bowiem wykorzystywany w środkach wybuchowych mogących zadawać rany lub śmierć, lecz także rozsadzać skały przy budowie tuneli, a nawet służyć jako lek ludziom zagrożonym zawałem serca.
Nitrogliceryna, którą “sercowcy” biorą pod język, ma zdolność rozszerzania naczyń wieńcowych. Gdy byłem chemikiem i myślałem tylko kategoriami chemicznymi byłem przekonany, że nitrogliceryna powoduje w naczyniach krwionośnych mikroeksplozje, które je poszerzają. Gdy jednak zostałem biologiem dowiedziałem się, że za zbawienne działanie tego leku przeciwzawałowego odpowiedzialna jest mała, prosta cząsteczka – tlenek azotu, o wzorze chemicznym NO powstająca z nitrogliceryny w organizmie. Jest ona wszechstronnym regulatorem wielu procesów zachodzących w żywych organizmach i właśnie ich omówieniem zajmę się w tym artykule.

ODROBINA HISTORII

Tlenek azotu jako związek chemiczny odkryty został, podobnie jak tlen, w 1770 roku przez Josepha Priestleya. Badania nad biochemią NO zaczęły się natomiast dopiero w 1977 roku, kiedy stwierdzono, że NO jest aktywnym metabolitem takich związków rozszerzających naczynia krwionośne jak nitrogliceryna i nitroprusydek sodu. Stwierdzono również, że NO aktywuje cyklazę guanylową – enzym produkujący cykliczny GMP (cGMP) – cząsteczkę będącą wtórnym przekaźnikiem, znaną już od 1963 roku.
W 1980 roku stwierdzono, że endotelium (śródbłonek) wyściełający naczynia krwionośne produkuje łatwo dyfundującą cząsteczkę, która powoduje rozszerzenie mięśni gładkich naczyń. Została ona wtedy nazwana EDRF (endothelium – derived relaxing factor). W 1986 zidentyfikowano ją jako tlenek azotu.
W 1992 roku NO został nazwany przez czasopismo “Nature” cząsteczką roku, a 6 lat później, w 1998 roku trzech naukowców: Murad, Furchgott i Ingarro otrzymują Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za pracę nad ciągiem przemian metabolicznych:

• L-arginina › NO.
• Odkrywcą samego EDRF był Furchgott.

 

PODSTAWY BIOCHEMII NO

Azot jest pierwiastkiem o niesłychanej zdolności do tworzenia tlenków. Tworzy ich aż siedem : N2O, NO, N2O2, N2O3, NO2, N2O4, N2O5 i jest to absolutny rekord tablicy Mendelejewa. Najważniejszymi z nich są: N2O – podtlenek azotu – tzw. gaz rozweselający używany jako środek uśmierzający ból, NO2 – dwutlenek azotu – brązowy gaz będący jednym z głównych związków chemicznych, którymi przemysł zanieczyszcza powietrze i NO – bezbarwny gaz będący bohaterem tego artykułu.
Cząsteczka NO ma małą masę, co w warunkach danej temperatury organizmu i stałej średniej energii kinetycznej wszystkich cząstek go budujących sprawia, że będzie ona miała relatywnie większą prędkość. To natomiast pozwoli jej pokonywać szybko dystanse podczas dyfuzji. Maksymalny dystans dyfuzji w tkankach wyznaczono na 500 µm gdyż NO jest nietrwała. Dodatkowym atutem NO jest jego obojętny ładunek elektryczny, co ułatwia dyfuzję w roztworach wodnych i przez spolaryzowane błony biologiczne.
W stężeniach fizjologicznych (10nM – 5 µM) czas półtrwania (t1/2) cząsteczki NO wynosi 1-30 s. Tlenek azotu łatwo utlenia się w organizmie bez pomocy żadnych enzymów do azotynu NO2-, którego czas półtrwania wynosi tylko 110 s. Azotyn szybko przechodzi w stabilny azotan NO3- (t1/2 = 8 h) i to właśnie anion NO3- jest ostatecznym metabolitem NO wydalanym z moczem. Tlenek azotu jest produkowany w organizmie z L-argininy przez enzym – syntazę tlenku azotu (NOS) w reakcji :

L-arginina + NADPH + O2 › L-cytrulina + NADP + H2O + NO

 

Znanych jest już 5 izoform syntazy tlenku azotu :

• mózgowa ( bNOS ) – cytozolowa, eksprymowana konstytutywnie w ok. 2% neuronów mózgu a także w nerkach i płucach.
• endotelialna ( eNOS ) – śródbłonkowa, poddawana potranslacyjnej obróbce mirystylacji i palmitynacji, eksprymowana konstytutywnie w komórkach śródbłonka.
• makrofagowa ( macNOS ) – cytozolowa, indukowalna, eksprymowana w makrofagach, komórkach Kupfera (makrofagach wątroby), mięśniach gładkich i chondrocytach.
• hepatocytarna ( hepNOS ) – indukowalna, eksprymowana w hepatocytach
• mitochondrialna ( mtNOS ) – wiadomo tylko, że mitochondria z wszystkich tkanek potrafią syntetyzować NO, lecz wciąż niewiadomo jaką ten enzym ma strukturę i jak jest regulowany.

Stwierdzono, że macNOS ma 50% homologii z bNOS, 51% homologii z eNOS i 82% homologii z hepNOS. Domeny wiążące NADPH, kalmodulinę, FMN i FAD są silnie konserwowane ewolucyjnie. Najbardziej zbliżoną sekwencję do NOS ma reduktaza cytochromu P450 (CPR).
NOS jest jednym z najróżnorodniej regulowanych enzymów znanych biochemikom. Fosforylacja obniża jej aktywność, podobnie jak przyłączenie NO i CO. Tetrahydrobiopteryna (Bh4) wzmaga aktywność tego enzymu. Na uwagę zasługuje hamowanie przez NO, będące przykładem najkrótszej pętli sprzężenia zwrotnego ujemnego jaka może istnieć. Produkt enzymu jest również jego inhibitorem.
Udział tlenku azotu w przekazywaniu sygnału w organizmie polega głównie na aktywacji enzymu: cytozolowej cyklazy guanylowej (sGC). Oprócz sGC istnieje również śródbłonowa cyklaza guanylowa – pGC. Warto tutaj wspomnieć, że cyklaza adenylowa – AC produkująca inny wtórny przekaźnik – cAMP jest enzymem tylko śródbłonowym.
Cytozolowa cyklaza guanylowa jest hemoproteiną, a jon żelaza Fe3+ zawarty w pierścieniu hemowym jest związany koordynacyjnie z pięcioma ligandami. NO aktywuje cyklazę guanylową przez utworzenie z Fe3+ w pierścieniu hemowym sGC szóstego wiązania koordynacyjnego, co wymusza zmiany w strukturze przestrzennej enzymu.

A oto reakcja katalizowana przez sGC :

GTP › cGMP + PPi

Powstały cGMP aktywuje :

• kinazy zależne od cGMP
• fosfodiesterazy zależne od cGMP
• kanały jonowe (tzw. cGMP – gated channels)

Po omówieniu syntezy NO i naszkicowaniu części schematu procesów w jakie jest zaangażowany pozostaje nam kwestia regulacji syntezy tlenku azotu. Jako, że bNOS i eNOS są eksprymowane konstytutywnie, a macNOS i hepNOS są indukowalne, jest rzeczą oczywistą, że regulacja aktywności dwóch pierwszych enzymów odbywać się będzie na poziomie aktywacji, a dwóch ostatnich – na poziomie ekspresji ich genów, choć tu aktywacja jest również możliwa.
I tak bNOS jest zależna od kalmoduliny i aktywują ją jony wapnia związane z kalmoduliną. Podniesiony poziom jonów wapnia powstaje w wyniku pobudzenia receptorów NMDA neuronu przez glutaminian. Endotelialna NOS – eNOS jest również aktywowana przez kompleks kalmodulina-Ca2+, lecz tym razem za podniesiony poziom wapnia w komórkach śródbłonka odpowiedzialny jest cykl fosfoinozytolowy, aktywowany przez receptory muskarynowe stymulowane acetylocholiną. Pozostałe izoformy – macNOS i hepNOS nie są obecne w wymienionych już komórkach, dopóki nie zajdzie ekspresja ich genów w wyniku oddziaływania tych komórek z lipopolisacharydami (LPS) pochodzącymi z komórek bakterii, interleukiną-1ß, interferonem-? lub TNF-?. Trzeba tu nadmienić, że hepNOS i macNOS są mocno związane z kalmoduliną, lecz kompleksy te nie są wrażliwe na jony Ca2+ (patrz rys.1).

Rys.1. Schemat procesów prowadzących do indukcji lub aktywacji różnych izoform NOS.

S-NITROZYLACJA – BEZPOŚREDNIA DROGA DZIAŁANIA NO

Aktywacja cyklazy guanylowej nie jest jedynym sposobem, w jaki działa tlenek azotu. Istnieje również prostsza, bezpośrednia droga. Jest nią S-nitrozylacja białek. Liczba tych, u których znaleziono znitrozylowane in vivo reszty cystein wzrasta i już dzisiaj przypuszcza się, że ta modyfikacja potranslacyjna jest tak powszechna i istotna jak fosforylacja.
Cysteina jest jednym z 20 aminokwasów wchodzących w skład białek. Jej łańcuch boczny zawiera grupę sulfohydrylową -SH, która jest uważana za najbardziej reaktywną grupę istniejącą w białkach. Tlenek azotu reaguje w komórce z tlenem lub kationami metali o właściwościach utleniających z wytworzeniem jonu nitrozoniowego NO+. Jon ten jest bardzo reaktywny i łączy się z grupą -SH cysteiny przechodząc w grupę nitrozotiolową -SNO.
Jak selektywna jest S-nitrozylacja ? Badania wykazały, że nie każda cysteina w nie każdym białku reaguje z kationem nitrozoniowym. Musi więc istnieć jakieś wyszczególniające cysteinę sąsiedztwo. Znaleziono już taką sekwencję konsensusową. Oto ona :

XYCys(Asp lub Glu) gdzie :
X może być którymś z następujących aminokwasów : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr lub Gln a Y może być którymś z następujących aminokwasów : Lys, Arg, His, Asp lub Glu.

Stwierdzono, że w warunkach fizjologicznych reakcje NO+ z grupami –CH i –NH nie są faworyzowane i dlatego obserwujemy tylko powstawanie nitrozotioli.
Ciekawą własnością tych związków jest ich względna stabilność. Jak już wiadomo w warunkch i stężeniach fizjologicznych czas półtrwania NO wynosi 1-30 s.
S-nitrozoalbumina (SNO-Alb) ma natomiast t1/2 = 40 min, S-nitrozoglutation (GSNO) ma t1/2 = 8 min a S-nitrozohemoglobina (SNO-Hb) – t1/2 = 1 min. Nie należy mylić SNO-Hb z nitrozylohemoglobiną, która powstaje w wyniku utworzenia przez NO szóstego wiązania koordynacyjnego z jonem żelaza hemu. Warto tu nadmienić, że hemoglobina pozbawiona tlenu ma aż 1500 razy większe powinowactwo do NO niż do CO.

Rys.2. Porównanie anionu nadazotynowego z azotanowym.

Stabilność nitrozotioli czyni je znakomitymi związkami transportującymi tlenek azotu i buforującymi jego stężenia. Co ciekawe, nitrozotiole znacznie wolniej reagują z anionem nadtlenkowym O2- niż wolny NO, co zmniejsza stężenie groźnego produktu tych reakcji – anionu nadazotynowego ONOO-. Anion ten, będący izomerem anionu azotanowego NO3- (patrz rys. 2), jest niezwykle reaktywną cząsteczką, odpowiedzialną za wiele uszkodzeń DNA i błon lipidowych. Niskie stężenie nadazotynów jest więc korzystne dla całego organizmu.
S-nitrozoalbumina stanowi 85% wszystkich nitrozotioli osocza i podobnie jak S-nitrozoglutation ma własność rozszerzania naczyń krwionośnych i hamowania agregacji płytek krwi.
Stwierdzono ponadto ciekawe zjawisko regulacji transkrypcji przez S-nitrozylację. Czynnik transkrypcyjny p50 zmniejsza znacznie swoje powinowactwo do DNA po S-nitrozylacji. Wiadomo również, że ta obróbka potranslacyjna aktywuje takie białka jak: p21ras, Rac1, Cdc42, ERK, JNK i P38. Naukowcy odkryli również, że jedna z proteaz wirusa HIV-1 jest dezaktywowana przez S-nitrozylację. Jest to jeszcze jeden sposób będący próbą obrony przed tym wirusem. S-nitrozylacja reguluje również wiele typów kanałów jonowych, ale badania mające na celu poznanie szczegółów trwają. Dziś wiadomo tylko tyle, że kanały typu CNG (cyclic nucleotide-gated) otwierają się w wyniku S-nitrozylacji. Reduktaza rybonukleotydowa E.coli – enzym bardzo istotny w syntezie DNA jest hamowana przez S-nirozylację. Przypuszczalnie właśnie dlatego neutrofile występujące w drogach oddechowych mają wysokie stężenie GSNO, który służy za źródło zabójczego NO unieszkodliwiającego strategiczne białko intruza. Niekoniecznie oczywiście chodzi tutaj tylko o obronę przed E.coli.

GŁÓWNE FIZJOLOGICZNE ROLE NO

Podstawowymi polami działania tlenku azotu są trzy układy: nerwowy, krwionośny i immunologiczny.

1. Jaką funkcję pełni NO w układzie nerwowym?

W mózgowiu bNOS eksprymowana jest tylko w neuronach (2% ich całkowitej liczby). W móżdżku neurony zawierające syntazę NO są glutaminergiczne lub GABA-ergiczne. W korze mózgowej neurony z bNOS mają za neurotransmitery GABA lub neuropeptydy, natomiast w prążkowiu wszystkie neurony produkujące NO barwią się na somatostatynę i neuropeptyd Y. Bardzo duże ilości bNOS znajdują się też w podwzgórzu. Rola NO w mózgowiu nie jest całkowicie poznana. Naukowcy dysponują tylko punktowymi doniesieniami, które na razie nie tworzą spójnego obrazu.
Glutaminian działający na receptory NMDA neuronu stymuluje produkcję NO, który łatwo dyfunduje, by oddziaływać parakrynowo na pobliskie neurony podnosząc w nich poziom cGMP. Wiadomo konkretnie, że powstały cGMP aktywuje kinazę serynowo/treoninową, eksprymowaną w komórkach Purkinjego móżdżku. Cykliczny GMP reguluje również aktywność kanałów jonowych, zaangażowanych w przekazywanie informacji wizualnej i węchowej.
Ciekawym przykładem jest zaangażowanie NO w adaptację oczu owadów do ciemności. Zmniejszenie natężenia światła powoduje większą depolaryzację komórek jednobiegunowych znajdujących się tuż za fotoreceptorami. Powstały w wyniku depolaryzacji NO działa zwrotnie jako tzw. retrograde messenger na komórkę fotoreceptorową. Za pomocą molekuły typu retrograde messenger część presynaptyczna otrzymuje potwierdzenie pomyślnego dotarcia uwolnionego z niej neuroprzekaznika do celu i zadzialania w obszarze postsynaptycznym. W tym konkretnym przypadku NO powoduje wzrost poziomu cGMP w tej komórce, co zwiększa jej wrażliwość na światło.
Ponadto udokumentowane są już :

• hamujący wpływ NO na układ współczulny
• zaangażowanie NO w wytwarzanie LTP (long-term potentiation) w hipokampie mózgu. LTP jest niezbędny przy powstawaniu pamięci długotrwałej
• zaangażowanie NO w powstawanie odruchów przełykowych przy pobieraniu pokarmu

NO w połączeniu z O2- działa neurotoksycznie powodując nekrozę neuronów poprzez wytworzony nitroazotyn ONOO-. Powoduje on uszkodzenia DNA neuronu, co aktywuje syntetazę poliADP-rybozy (PARS). Enzym ten zużywa ogromne ilości NAD, który musi zostać odtworzony z ATP. Drastyczny spadek ATP w komórce kończy się jej obumarciem.

2. Jaką funkcję pełni NO w układzie krwionośnym ?

W wyniku działania różnych bodźców na komórki śródbłonka (stres, trombina, ADP, serotonina, bradykinina, histamina, norepinefryna, wazopresyna, substancja P i acetylocholina) produkowany jest NO, którego główną rolą w układzie krwionośnym polega na rozszerzaniu naczyń krwionośnych. Tworzące się nitrozotiole: nitrozoalbumina i nitrozoglutation mają również tą własność, co wolny NO, z tym że dodatkowo hamują agregację płytek krwi. Wysokie stężenie O2- jest w układzie krwionośnym niepożądane. Wyrzut dużej ilości nadtlenków występuje przy infekcjach, niedotlenieniu i następującej po nim reperfuzji (ponownym ukrwieniu tkanki). Aniony nadtlenkowe utleniają LDL (low density lipoproteins) osocza i powstały produkt powoduje skurcz naczyń krwionośnych. Zaobserwowano zjawisko skurczania naczyń wieńcowych zaatakowanych przez arteriosklerozę po zadziałaniu na nie acetylocholiny, choć normalnie działanie acetylocholiny jest rozkurczowe. Czynnikami zaburzającymi rozszerzanie przez NO są również : nadciśnienie, hipercholesterolemia i palenie.

3. Jaką funkcję pełni NO w układzie immunologicznym

Podstawową rola NO w układzie immunologicznym związana jest z aktywnością makrofagów. Są one potrzebne do obrony organizmu przed patogenami. Omawiana już indukcja ekspresji macNOS prowadzi do produkcji bardzo dużych ilości NO przez makrofagi. Wysokie stężenia NO stymulują w mitochondriach produkcję O2- i H2O2. NO i O2- łączą się z wytworzeniem wysokich stężeń znanego już jonu nadazotynowego. Cząsteczka ta ma czas półtrwania ok. 1 s, lecz to wystarczy aby zdążyła wyrządzić szkody. Oto ich lista :

• oksydacja tioli
• degradacja węglowodanów
• uszkodzenia DNA
• utlenianie lipidów
• hamowanie oddychania mitochondrialnego

W przypadku makrofagów tworzenie nadazotynów jest pożądane, gdyż dyfunduje on głównie w kierunku komórki – intruza i zabija ją. Niestety, powtarzające się infekcje i stany zapalne prowadzą do efektów ubocznych, gdyż wyrzucane przez makrofagi nadazotyny uszkadzają pobliskie tkanki. Ale tym zajmiemy się w następnym rozdziale.
Co ciekawe, NO w małych ilościach istniejących przy braku aktywacji makrofagów działa przeciwzapalnie poprzez stymulację produkcji prostaglandyn.
Ponadto NO nie tylko bierze udział w odpowiedzi immunologicznej, lecz także jest jej regulatorem. Indukuje on w makrofagach transkrypcję IL-12 – silnego immunostymulatora. Hamuje natomiast ekspresję IFN g i IL-2. Hamowanie ekspresji genu IL-2 odbywa się przez usuwanie przez NO kationów cynku z palców cynkowych czynnika transkrypcyjnego Sp1/EGR1.

INFEKCJA DRĄŻY ORGANIZM

Kiedy byłem mały wykryto u mnie wysoki poziom antystreptolizyny we krwi. Był to objaw obrony organizmu przed infekcją paciorkowcem. Lekarka szybko zaaplikowała mi takie ilości zastrzyków, że do dzisiaj zapach “szpitalny” powoduje w moim organizmie wyrzut dużych ilości adrenaliny. Było to jednak konieczne, gdyż paciorkowce zagrażały sercu. Wtedy przytaknąłem lekarce, ale nieco później usłyszałem o powszechnie uznawanej teorii głoszącej, że choroba wieńcowa (CHD) indukowana jest przez stres i podniesiony poziom cholesterolu ponad 200 mg%. Co wspólnego miały z tym paciorkowce ? Późniejsze badania pokazały, że istnieją przypadki, których powyższa teoria nie ujmuje. U niektórych ludzi CHD rozwijała się pomimo bezstresowego życia i normalnego poziomu cholesterolu. Jak się później okazało, za te przypadki odpowiedzialny był tlenek azotu wydzielany z makrofagów podczas procesów zapalnych (szczególnie chronicznych). Makrofagowy NO może osiągać w tętnicach 1000 razy większe lokalne stężenia niż NO endotelialny. Powstający szybko ONOO- indukuje nadprodukcję prostaglandyn i leukotrienów, które stymulują powstawanie płytek arteriosklerotycznych. Wyrzut dużych ilości nadazotynów nie jest problemem tylko układu krwionośnego. Zjawisko to jest odpowiedzialne za ogólną utratę neuronów z wiekiem wskutek opisanej już ich nekrozy (organizm po coraz większej ilości infekcji). Na przykład obumieranie neuronów termowrażliwych u ludzi starszych objawia się u nich obniżoną odpowiedzią gorączkową na infekcje. Ponadto uszkodzenia dopaminergicznych neuronów prążkowia i substancji czarnej prowadzą do parkinsonizmu. Potwierdzeniem tych obserwacji są przypadki wczesnego rozwinięcia parkinsonizmu u żołnierzy walczących w I Wojnie Światowej, gdyż często chorowali oni na grypę. Ten sam mechanizm prawdopodobnie odpowiedzialny jest za objawy parkinsonizmu u ludzi chorujących na AIDS, a także wczesne starzenie się skóry u ludzi często zażywających kąpieli słonecznych.

NO – TYSIĄCE RAZY WYDAJNIEJSZY NIŻ WITAMINA E

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe wchodzą w skład błon lipidowych. Mają one tendencje utleniania się do końcowych produktów: aldehydów, hydronadtlenków i alkoholi. Powstające spontanicznie w organizmie produkty pośrednie: wolne rodniki kwasów tłuszczowych reagują szybko z tlenem, z wytworzeniem rodników nadtlenkowych KT. Mają one zdolność do wytwarzania następnych rodników nadtlenkowych KT w reakcji, która przypomina przewracanie się kawałków domina:

LOO* + LH › LOOH + L*

L* + O2 › LOO*

Sumarycznie: LOO* + LH + O2 › LOOH + LOO*

Takie chemiczne “przewracające się domino” skończyłyby się poważnym uszkodzeniem błony lipidowej. Na ratunek przychodzi NO, ale tylko w wtedy gdy jego stężenie jest niewielkie. Reaguje on z LOO* przechodząc w związki nieszkodliwe i przerywając przewracanie domina. W roli “oczyszczacza” wolnych rodników (ang. scavenger) jest 10000 – 100000 razy wydajniejszy niż witamina E (tokoferol), zwana również witaminą młodości.
W dużych stężeniach NO staje się szkodliwy. Hamuje on peroksydazę glutationową – znany dobrze biochemikom enzym zawierający atom selenu. Peroksydaza glutationowa również unieszkodliwia nadtlenki przeprowadzając je w alkohole. Tlenek azotu po połączeniu z O2- przechodzi w nadazotyn inicjujący peroksydację lipidów. Efekt jego działania jest więc wtedy przeciwny do tego, który wywiera sam. Możnaby go porównać do ratlerka, który łasi się do obcych, ale gdy zobaczy pana zaczyna szczekać.

NO – MITOCHONDRIALNY KONKURENT TLENU

Mitochondria potrafią same produkować tlenek azotu za pomocą jeszcze słabo poznanego enzymu – mtNOS zlokalizowanego w wewnętrznej błonie białkowo – lipidowej tych organelli.
NO służy jako regulator oddychania mitochondrialnego. Wiąże się on z enzymem – oksydazą cytochromu c (kompleks IV) – ostatnim enzymem łańcucha oddechowego inhibując go. Kompleks IV jest odpowiedzialny za zużycie 90% tlenu komórki. NO konkuruje z tlenem o to samo miejsce w tym enzymie. Inhibicja jest odwracalna.
U psów stwierdzono, że inhibitor NOS – N-nitrozo L-arginina (NMA) powoduje szybki wzrost całkowitego zużycia tlenu przez ich organizmy o 25%. Obecność NO obniża więc intensywność oddychania mitochondrialnego w sposób znaczący. NO stymuluje też produkcję innych inhibitorów. Ma on zdolność wzmagania produkcji jonów nadtlenkowych przez kompleks III łańcucha oddechowego. Znana już reakcja NO z nadtlenkami wytwarza nadazotyny, które inhibują dodatkowo: syntetazę ATP, kompleks II (dehydrogenazę bursztynianową), kompleks I (oksyreduktazę NADH – ubichinon) i jeden z enzymów cyklu Krebsa – akonitazę.
Jako, że NO inhibuje także przez S-nitrozylację ważny enzym biorący udział w glikolizie – dehydrogenazę 3P-gliceraldehydową, można ogólnie nazwać tlenek azotu inhibitorem syntezy ATP w komórce.

DWA OBLICZA NO W APOPTOZIE

Rola tlenku azotu w zjawisku apoptozy jest dwoista. W artykułach naukowych można przeczytać, że może wywierać on wpływ hamujący i indukujący zaprogramowaną śmierć komórki. Wydaje się to mieć taki sens jak dodawanie gazu w samochodzie przy włączonych hamulcach. Musi więc być jakiś czynnik wyszczególniający dany rodzaj wywieranego efektu i jest nim stężenie NO.
1. Efekt proapoptotyczny (wysokie stężenia NO)
NO w wysokich stężeniach dezaminuje zasady azotowe DNA (także w postaci nadazotynu). Uszkodzenia te zwiększają poziom białka p53, które ma zdolność indukowania apoptozy.

2. Efekt antyapoptotyczny (niskie stężenia NO)
Udokumentowano już hamujący wpływ NO na apoptozę u takich komórek jak limfocyty B, eozynofile, hepatocyty i komórki śródbłonka. Hamowanie apoptozy odbywa się z wykorzystaniem dwóch podstawowych dróg regulacji aktywności białek. Strategicznymi białkami w apoptozie są tzw. kaspazy (proteazy cysteinowe). Mogą one zostać zdezaktywowane albo przez fosforylację (kaspaza degradująca Bcl-2, co jest istotne do zajścia apoptozy) albo przez S-nitrozylację (kaspaza-1 i kaspaza-3).

CIEKAWOSTKI

a) O pluskwie, co zastosowała tlenek azotu
Gatunek pluskwiaka o nazwie łacińskiej Rhodnius prolixus żywi się krwią, którą wysysa z organizmów, na których pasożytuje. Ślinianki tego pluskwiaka produkują ślinę bogatą w białka związane z tlenkiem azotu. Po ukąszeniu, wstrzyknięta do naczynia krwionośnego ślina uwalnia NO, co powoduje rozszerzenie naczynia i większy napływ krwi, która stanowi pokarm.

b) Zawał – męska rzecz
Jak już wiadomo NO w stężeniach niskich, nie powstających w wyniku aktywacji makrofagów, działa rozszerzająco na naczynia krwionośne, chroni błony lipidowe przed utlenieniem prowadzącym do zmian sklerotycznych, a także zapobiega agregacji płytek krwi. Należy więc oczekiwać, że podwyższony poziom tlenku azotu w tętnicach będzie dobrą ochroną przed chorobą wieńcową. Nie mówimy tutaj oczywiście o stężeniach 1000-krotnie większych, które powstają przy infekcjach i są w przewlekłych stanach zgubne. U kobiet zaobserwowano korelację wysokiego poziomu estrogenów z wysokim poziomem tlenku azotu. Jest to obserwacja fenomenologiczna czyli stwierdzono pewną zależność nie znając jej mechanizmów. Wyjaśnia ona jednak powszechnie znany fakt mówiący, że kobiety znacznie rzadziej niż mężczyźni dostają zawału serca. Nie możemy tutaj oczywiście wykluczyć pozytywnego wpływu innych czynników, np. mniejszy procent palaczy wśród kobiet.

c) VIAGRA – lek, który uczynił niejedną jesień pogodną
VIAGRA jest lekiem na impotencję, o którym sporo mówiło się we wszelkiego rodzaju masmediach. Jest to jego nazwa handlowa, a związek chemiczny nosi nazwę sildenafil (patrz rys.3.).

Rys.3. Wzór strukturalny VIAGRY (sildenafilu)

Tlenek azotu wydzielany jest przez nerwy jamiste i dyfunduje w kierunku mięśni gładkich tętniczek i ciał jamistych prącia. W wyniku rozkurczu tych mięśni do penisa napływa krew, co powoduje erekcję. Rozkurcz mięśni gładkich następuje w wyniku aktywacji przez NO cytozolowej cyklazy guanylowej i produkcji cGMP. I to właśnie poziom cGMP jest obniżony u impotentów i to właśnie stężenie cGMP ma za zadanie podnieść VIAGRA. Jak tego dokonuje?
Przez organizmy żywe ciągle przepływa energia i utrzymuje je w stanie dalekim od równowagi chemicznej. Żeby ten stan był stabilny, a związki osiągały wysokie stężenia, potrzebna jest ciągła produkcja, która równoważy rozpad samoczynny lub katalizowany przez enzymy. Spójrzmy na poniższy rysunek 4:

Rys.4. Obrazowe przedstawienie działania VIAGRY (porównanie poziomu wody w dwóch zlewach różniących się średnicą odpływu)

W organizmie cGMP (woda) produkowany jest przez cyklazy guanylowe (kran) , lecz nie może on gromadzić się w nieskończoność. Istnieją enzymy, które metabolizują rozpad. Nazywają się fosfodiesterazy (odpływ). Znanych jest 9 rodzin fosfodiesteraz: PDE 1-9.
Sildenafil jest znakomitym inhibitorem PDE 5 i PDE 6, które występują właśnie w mięśniach gładkich naczyń. Inhibicja tych fosfodiesteraz (zwężenie odpływu) powoduje wzrost poziomu cGMP w komórce mięśnia gładkiego i jej rozkurcz, co prowadzi do erekcji.
Sildenafil osiąga swoje maksymalne stężenie we krwi 0,5-2 h po zażyciu tabletki, dlatego przeciętnie lekarze zalecają zażycie VIAGRY na godzinę przed stosunkiem.

d) Słabszy bliźniak czyli co wiemy o CO ?
Tlenek węgla, zwany też czadem, jest odpowiedzialny już za niejedno zatrucie często kończące się śmiercią. Ten bezbarwny, bezwonny gaz ma 300 razy większe powinowactwo do hemoglobiny niż tlen. Jeśli pojawi się we wdychanym powietrzu, np. wskutek spalania węgla przy małym dostępie powietrza, bardzo wydajnie wysyca hemoglobinę, co powoduje niedostateczne dotlenienie tkanek i przy braku ratunku – śmierć.
W bardzo niskich stężeniach CO jest jednak produkowany w organizmach żywych przez enzymy: oksygenazę hemową-1 i -2. Ma on bardzo podobną strukturę do tlenku azotu i podobnie jak on potrafi inhibować syntazę NO i aktywować sGC, z tym że 80 razy słabiej.

KONKLUZJE

Tlenek azotu po 20 latach badań nad jego biochemią jawi się jako molekuła biorąca udział w bardzo wielu procesach w organizmie. Wymieńmy najważniejsze role NO :

• parakrynowy neurotransmiter w układzie nerwowym
• związek rozkurczający naczynia krwionośne i hamujący agregację płytek krwi
• cząsteczka współodpowiedzialna za cytotoksyczność makrofagów
• regulator odpowiedzi immunologicznej
• związek oczyszczający komórkę z wolnych rodników
• regulator oddychania mitochondrialnego
• regulator aktywności wielu kinaz i czynników transkrypcyjnych (poprzez cGMP lub S-nitrozylację)
• inhibitor apoptozy

Bardzo wysokie stężenia NO powstające z makrofagów podczas zapaleń (szczególnie chronicznych), oprócz niszczenia patogenów, wywierają negatywny wpływ na komórki organizmu indukując ich apoptozę, nekrozę a także zmiany sklerotyczne naczyń krwionośnych.
Niniejszy artykuł przedstawia najważniejsze wyniki badań nad biochemią NO z ostatnich 20 lat. Są one imponujące. Należy przypuszczać, że artykuł przeglądowy pisany za 20 lat będzie daleko obszerniejszy.